Esami in NGS (Next Generation Sequencing)

• preparazione della sequencing library;
• reazione di amplificazione;
• reazione di sequenziamento.

1. 1. PREPARAZIONE E IMMOBILIZZAZIONE DEL DNA (OVVERO CREAZIONE DELLA SEQUENCING LIBRARY)

   1. Il campione di DNA viene preparato attraverso un processo di frammentazione casuale, a questi vengono aggiunte delle sequenze predefinite (adaptors), necessarie per ancorare e immobilizzare i frammenti al supporto sul quale avrà luogo la reazione di sequenziamento, formando nel loro insieme la libreria di sequenziamento (sequencing library). Esistono almeno tre diversi tipi di adattatori e quindi tre diversi modi di preparare la sequencing library: adattatori lineari, adattatori circolari e adattatori a bolla. Esistono naturalmente anche tipi di supporto di ancoraggio diversi: ad esempio, nel sistema SOLiD i frammenti vengono ancorati ad una lastra di vetro.
   

2. Fig. 1: rappresentazione schematica di una sequencing library per la next generation sequencing:
   a: supporto;
   b: adattatori;
   c: frammenti di DNA ancorati al supporto (immobilizzati) tramite gli adattatori.
3. AMPLIFICAZIONE
   L’amplificazione può essere fatta in emulsione (sistema Roche e sistema SOLiD) o in soluzione. Nel sistema GS FLX (Roche) un frammento della sequencing library viene incorporato in una microscopica bolla di acqua assieme a dei cosiddetti enrichment beads, piccole sfere a cui gli adattatori si possono legare.
   La reazione di amplificazione (PCR) viene fatta in questa microbolla acquosa, all’interno della quale il frammento di DNA viene amplificato numerose volte.
   Le copie clonali del frammento si legano poi all’enrichment bead ricoprendone la superficie. Gli enrichment beads così ottenuti vengono poi depositati sulla piastra Picotiter.
4. SEQUENZIAMENTO
   

   Il sequenziamento avviene grazie a complessi meccanismi fluidici che regolano il flusso dei reagenti che vanno a cimentarsi col DNA immobilizzato. Ogni ciclo di sequenziamento consiste in diversi step:
   – cimentare il DNA immobilizzato con una soluzione contenente un nucleotide;
   – successivo lavaggio;
   – registrazione dell’evento molecolare appena verificatosi. La registrazione dell’evento molecolare avviene con un sistema per immagini: se la reazione
   di incorporazione del nucleotide nel filamento complementare crescente avviene in concomitanza all’emissione di un lampo di luce, si parla di pyrosequencing del sistema GS FLX Roche; se, invece, si utilizza la macchina Ion Torrent (Life Technologies), la registrazione utilizza un sistema di rilevazione diverso,
   con semiconduttore, che riconosce l’emissione di ioni idrogeno rilasciati durante la reazione di polimerizzazione del DNA.

I sistemi NGS consentono un’elevata resa di sequenziamento, grazie al fatto che tutti i frammenti immobilizzati sul supporto di sequenziamento vengono sequenziati contemporaneamente in parallelo (a differenza del Sanger sequencing tradizionale, in cui si può sequenziare un solo frammento per volta). Esistono differenze
nel procedimento di incorporazione dei nucleotidi a seconda dei sistemi utilizzati:

• nel pyrosequencing del sistema GS FLX Roche e nel sistema Ion Torrent (Life Technologies) ogni nucleotide viene interrogato singolarmente;
• nei sistemi Illumina i quattro nucleotidi vengono interrogati in parallelo, ma solo il nucleotide terminatore complementare (terminator nucleotide) si lega, poiché ognuno dei quattro nucleotidi terminatori dispone di una parte che inibisce il legame degli altri tre;
• il sistema PacBio RS utilizza nucleotidi che recano un fluoroforo che viene staccato durante la reazione di incorporazione;
• i sistemi SOLiD e CGA utilizzano oligonucleotidi degenerati marcati con fluorocromi.

Completata la fase di sequenziamento, i dati ottenuti vengono analizzati e filtrati mediante analisi bioinformatica per agevolarne la refertazione.